Cucurbituryle w farmakologii – nowe możliwości dla systemów lekowych

Czy cucurbituryle otwierają nowe horyzonty w farmakologii?

Badania nad kompleksami supramolekularnymi typu gospodarz-gość zyskują coraz większe znaczenie w farmacji, szczególnie w kontekście modyfikacji właściwości fizykochemicznych leków. Tworzenie takich kompleksów poprzez włączenie małej cząsteczki organicznej do wnętrza struktury makrocyklicznej stanowi prostą i praktyczną metodę modulowania rozpuszczalności, stabilności oraz biodostępności substancji leczniczych. Wśród makrocyklicznych cząsteczek gospodarzy, takich jak cyklodekstryny, kaliks[n]areny czy pillar[n]areny, szczególnie interesującą grupą są cucurbit[n]uryle, charakteryzujące się wyjątkowymi właściwościami kompleksującymi oraz biokompatybilnością.

Cucurbit[n]uryle to rodzina związków makrocyklicznych o strukturze przypominającej dynię, zbudowanych z n (n = 5, 6, 7, 8 i 10) jednostek glikolurylu połączonych parami grup metylenowych. Taka cykliczna struktura tworzy dwa identyczne, częściowo ujemnie naładowane hydrofilowe portale karbonylowe po obu stronach oraz hydrofobową wnękę, której rozmiar zwiększa się wraz z liczbą jednostek glikolurylu. Dzięki tym właściwościom cucurbit[n]uryle mogą tworzyć stabilne i odwracalne kompleksy gospodarz-gość z różnymi kationowymi lub neutralnymi cząsteczkami gościa poprzez oddziaływania niekowalencyjne, takie jak oddziaływania jon-dipol, wiązania wodorowe i efekty hydrofobowe. Szczególnie cucurbit[7]uryl (CB7), charakteryzujący się dobrą rozpuszczalnością w wodzie i odpowiednim rozmiarem wnęki (średnica portalu 5,4 Å, średnica wnęki 7,3 Å i objętość wnęki 279 ų), ma znaczny potencjał w zastosowaniach biomedycznych.

Istnieje wiele przykładów leków lub związków biologicznie czynnych, które badano w połączeniu z CB7, obejmujących szeroki zakres zastosowań, np. w znieczuleniu miejscowym, leczeniu infekcji czy lekach przeciwnowotworowych. Poprzez tworzenie kompleksów gospodarz-gość, CB7 może regulować uwalnianie leków i łagodzić skutki uboczne, poprawiając stabilność i rozpuszczalność leków w wodzie. Na przykład, cytotoksyczność heptalatyny, chemioterapeutyku na bazie platyny stosowanego w leczeniu guzów jelita grubego, wobec normalnych komórek jelita grubego może być znacznie zmniejszona poprzez tworzenie kompleksów gospodarz-gość z heptalatyna-CB7, zmniejszając tym samym cytotoksyczność heptalatyny podczas podawania. Co ważniejsze, aktywność przeciwnowotworowa kompleksu heptalatyna-CB7 jest wyższa niż samej heptalatyny.

W porównaniu do formulacji opartych na β-cyklodekstrynie, CB7 wykazuje wyższe stałe wiązania z gościem, co czyni go bardziej efektywnym niż β-cyklodekstryna jako substancja pomocnicza poprawiająca rozpuszczalność słabo rozpuszczalnych leków. Niedawno stwierdzono, że stała trwałości kompleksu CB7 z niesteroidowym lekiem przeciwzapalnym (NLPZ) piroksykamem jest około 70-krotnie wyższa niż z β-cyklodekstryną. Ponadto, kompleks inkluzyjny CB7-piroksykam wykazał szybką szybkość rozpuszczania w środowisku żołądkowym i znacznie wyższą biodostępność po podaniu doustnym w porównaniu do kompleksu z β-cyklodekstryną, co skutkowało poprawą działania przeciwzapalnego zarówno w modelach mysich, jak i szczurzych.

Czy analiza kompleksów NAB i NAP odsłania ich tajemnice?

W prezentowanym badaniu analizowano tworzenie kompleksów gospodarz-gość pomiędzy CB7 a dwoma strukturalnie podobnymi niesteroidowymi lekami przeciwzapalnymi (NLPZ): nabumetonem (NAB) i naproksenem (NAP). Naproksen jest aktywną formą leku, podczas gdy nabumetone jest prolekiem, który generuje aktywną cząsteczkę 6-metoksy-2-naftylooctową (6-MNA) poprzez reakcje metaboliczne. Naproksen zawiera sztywny pierścień naftalenowy, podstawnik metoksylowy i chiralny łańcuch boczny α-metylooctowy. Przy fizjologicznym pH cząsteczka ta występuje głównie w formie anionowej (pKa ≈ 4,2) i ma zarówno domeny hydrofobowe (aromatyczne), jak i polarne (karboksylanowe). Nabumetone, z kolei, posiada wspólny z naproksenem podstawiony metoksylem pierścień naftalenowy, ale ma neutralny łańcuch boczny butanonu, co skutkuje niejonizującym, bardziej lipofilowym profilem.

Badania kompleksów NAB-CB7 i NAP-CB7 przeprowadzono za pomocą różnych technik analitycznych. Spektrometria mas wysokiej rozdzielczości potwierdziła tworzenie kompleksów 1:1 w roztworze dla obu badanych układów. Eksperymenty z dysocjacją indukowaną zderzeniami (CID) wykazały, że kompleks NAB-CB7 wykazuje większą stabilność w fazie gazowej w porównaniu z kompleksem NAP-CB7, co sugeruje silniejsze oddziaływania międzycząsteczkowe. Jony prekursorowe kompleksów NAP-CB7 i NAB-CB7 zostały całkowicie zużyte przy wartościach CE wynoszących odpowiednio 14 i 15 eV. Obliczone wartości CE50 dla zużycia [CB7 + NAP + 2NH4]2+ i [CB7 + NAB + 2NH4]2+ wynosiły odpowiednio 7,07 ± 0,02 (R2 = 0,99) i 9,22 ± 0,04 (R2 = 0,99), wskazując, że kompleks NAB-CB7 wykazuje większą stabilność w fazie gazowej w porównaniu ze strukturalnie podobnym niekowalencyjnym kompleksem NAP-CB7.

Spektroskopia NMR dostarczyła cennych informacji strukturalnych o tworzonych kompleksach. Analiza widm 1H NMR wykazała znaczące zmiany w przesunięciach chemicznych protonów NAB i NAP po kompleksacji, szczególnie dla protonów aromatycznych, co wskazuje na włączenie cząsteczek gości do wnętrza hydrofobowej wnęki CB7. Porównanie widma NAB z widmem protonowym kompleksu NAB-CB7 1:1 pokazuje, że rozpuszczalność kompleksowanego NAB jest znacznie wyższa niż formy wolnej. Przesunięcie w górę pola protonów aromatycznych NAB, jak również protonów 11 i 12, sugerowało włączenie całej cząsteczki NAB do wnęki, podczas gdy grupy metylowe (protony 14 i 15) są wystawione na działanie masy w pobliżu portali CB7.

Eksperymenty 2D ROESY potwierdziły bliskość strukturalną między aromatycznymi protonami NAB a protonami H-1 CB7, co dodatkowo potwierdza tworzenie kompleksu inkluzyjnego. Spektroskopia DOSY NMR wykazała również różne współczynniki dyfuzji dla kompleksu NAB-CB7 (D = 2,66 × 10−10 m2/s), niezasocjowanego CB7 (D = 2,72 × 10−10 m2/s) i niezasocjowanego NAB (D = 3,24 × 10−10 m2/s), co potwierdza tworzenie się kompleksu w roztworze. Mała różnica we współczynnikach dyfuzji między CB7 a kompleksem jest konsekwencją małej różnicy wielkości między tymi dwoma związkami.

Czy termodynamiczne badania wyjaśniają zróżnicowane powinowactwo?

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC) została wykorzystana do zbadania termodynamicznych parametrów reakcji kompleksowania. Dla kompleksu NAB-CB7 wyznaczono stałą trwałości log K = 4,66, co wskazuje na efektywne wiązanie NAB przez CB7. Wartość ta jest o ponad rząd wielkości wyższa niż wartości stałych trwałości dla równoważnych kompleksów NAB z β-cyklodekstrynami. Parametry termodynamiczne pokazują, że wiązanie NAB jest korzystne zarówno entalpijnie, jak i entropijnie, przy czym bezwzględna wartość ΔrH° jest wyższa niż bezwzględna wartość TΔrS°.

Proces kompleksowania NAB z CB7 jest egzotermiczny, co jest oczekiwane i typowe dla cucurbituryli. Cząsteczki wody wewnątrz wnęki CB7 są strukturalnie i energetycznie niekorzystne, np. mają mniejszą liczbę wiązań wodorowych niż w masie wody. Ponieważ cząsteczki te są uwalniane z wnęki podczas reakcji kompleksowania, wiązanie jest entalpijnie korzystne. Wartość entropii reakcji jest dodatnia. Entropia jest złożoną wielkością, której wartość jest wynikiem kilku wkładów, w tym entropii desolwatacji cząsteczki gościa po włączeniu do gospodarza i uwolnienia cząsteczek wody z wnęki. Ponieważ uwolnienie cząsteczek wody jest przewidywane jako entropijnie niekorzystne, entropia desolwatacji jest dominującą siłą związaną z procesem wiązania. Proces desolwatacji jest uważany za entropijnie korzystny. Jeśli efekt entropijny desolwatacji leku przeważa nad efektem uwolnienia cząsteczek wody z wnęki cucurbiturilu, entropia reakcji będzie dodatnia, jak ma to miejsce w przypadku badanej reakcji inkluzji.

Interesująco, nie zaobserwowano znaczącego tworzenia kompleksu między CB7 a NAP w eksperymentach ITC, ani przy pH 6,8, ani przy pH 2. Może to być wyjaśnione przez właściwości fizykochemiczne gospodarza i gościa przy różnych wartościach pH. Przy pH 6,8 NAP występuje głównie jako anion karboksylanowy, co powoduje znaczące odpychanie elektrostatyczne z ujemnie naładowanymi portalami karbonylowymi CB7, co prawdopodobnie zapobiega efektywnemu wnikaniu gościa do wnęki gospodarza. Ponadto, silna powłoka solwatacyjna wokół grupy karboksylanowej zwiększa energię desolwatacji, która nie jest wystarczająco kompensowana przez interakcje między CB7 a gościem.

Czy obliczenia teoretyczne potwierdzają eksperymentalne obserwacje?

Obliczenia DFT (teoria funkcjonału gęstości) zostały przeprowadzone w celu uzyskania zoptymalizowanych struktur dla systemów gospodarz-gość NAB-CB7, NAP(kwas)-CB7 i NAP(anion)-CB7 w stosunku 1:1. Obliczony moment dipolowy NAB, NAP (kwas) i NAP (anion) wynosi odpowiednio 4,35, 4,47 i 22,20 Debye. Goście są tylko częściowo osadzeni we wnęce, a grupy metylowe, karboksylowe i metoksylowe wystają poza gospodarza CB7. Objętość zanurzonej części gości można oszacować na 136 ų, a biorąc pod uwagę obliczoną objętość wewnętrznej wnęki CB7 wynoszącą 242 ų, współczynnik upakowania (PC) systemów gospodarz-gość wynosi 56%. Ta uzyskana wartość PC jest bliska regule upakowania Rebeka na poziomie 55%, sugerując bardzo wysokie powinowactwo wiązania.

Obliczone energie wiązania Gibbsa dla systemów gospodarz-gość NAB-CB7, NAP(kwas)-CB7 i NAP(anion)-CB7 w stosunku 1:1, po korekcie do stanów referencyjnych 1 M, wynoszą odpowiednio -39,7, -16,8 i -0,3 kJ mol-1, co jest w rozsądnej zgodności z eksperymentalnie uzyskanymi wartościami. Analiza IGMH (niezależny model gradientu oparty na podziale Hirshfelda gęstości molekularnej) przeprowadzona na zoptymalizowanych strukturach pokazuje, że słabe oddziaływania van der Waalsa odgrywają główną rolę w interakcji hydrofobowej wnęki CB7 z pierścieniami aromatycznymi i łańcuchami gości.

Czy różnice w kompleksacji mogą wpłynąć na skuteczność leków?

Wyniki badań wskazują, że NAB tworzy stabilny kompleks inkluzyjny 1:1 z CB7 w roztworze wodnym, ze stałą wiązania przekraczającą powinowactwo obserwowane dla β-cyklodekstryn, co podkreśla potencjał CB7 jako efektywnego gospodarza dla NAB. W przeciwieństwie do tego, CB7 wykazał znacznie niższe powinowactwo do NAP zarówno w jego neutralnej, jak i anionowej formie, podkreślając kluczową rolę grup funkcyjnych i właściwości kwasowo-zasadowych cząsteczek gości w tworzeniu kompleksów z CB7. Wyniki te są zgodne z badaniami nad kompleksacją NAB i NAP z β-cyklodekstrynami, które pokazują, że β-cyklodekstryny są lepszym wiązaczem dla NAB niż NAP.

Badania te mają istotne implikacje dla medycyny, szczególnie w kontekście opracowywania nowych formulacji leków. Kompleksacja leków z CB7 może prowadzić do poprawy ich rozpuszczalności, stabilności i biodostępności, co z kolei może przełożyć się na większą skuteczność terapeutyczną i mniejsze skutki uboczne. Jest to szczególnie ważne w przypadku leków o niskiej rozpuszczalności w wodzie, takich jak nabumetone, gdzie kompleksacja z CB7 może znacząco poprawić ich profil farmakokinetyczny. Ponadto, wyniki te otwierają nowe perspektywy w projektowaniu systemów dostarczania leków opartych na CB7 i przyczyniają się do lepszego zrozumienia interakcji gospodarz-gość z udziałem cząsteczek o znaczeniu farmaceutycznym o różnych właściwościach funkcjonalnych.

Podsumowanie

Cucurbit[n]uryle, a szczególnie cucurbit[7]uryl (CB7), wykazują znaczący potencjał w zastosowaniach biomedycznych dzięki swoim unikalnym właściwościom kompleksującym. W przeprowadzonych badaniach analizowano tworzenie kompleksów między CB7 a dwoma lekami przeciwzapalnymi: nabumetonem (NAB) i naproksenem (NAP). Wykorzystując różnorodne techniki analityczne, w tym spektrometrię mas, spektroskopię NMR oraz kalorymetrię ITC, wykazano, że NAB tworzy stabilny kompleks z CB7, charakteryzujący się wyższą stałą wiązania niż analogiczne kompleksy z β-cyklodekstrynami. W przeciwieństwie do tego, NAP wykazał znacznie niższe powinowactwo do CB7, co przypisano jego właściwościom fizykochemicznym i obecności grupy karboksylanowej. Obliczenia teoretyczne potwierdziły eksperymentalne obserwacje, wskazując na dominującą rolę oddziaływań van der Waalsa w stabilizacji kompleksów. Wyniki badań sugerują, że kompleksacja z CB7 może znacząco poprawić właściwości farmakokinetyczne niektórych leków, otwierając nowe możliwości w projektowaniu systemów ich dostarczania.